MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN HLA-B27

Theo “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh cơ xương khớp” của Bộ Y tế ban hành kèm quyết định số 361/QĐ-BYT, xét nghiệm HLA-B27 là một trong những xét nghiệm cận lâm sàng nhằm hỗ trợ chẩn đoán bệnh AS. Việc chẩn đoán bệnh đúng thời điểm và kịp thời là mấu chốt để quản lý các bệnh lý liên quan đến cơ xương khớp và mang lại tiên lượng tốt hơn trong việc điều trị.⁴ Ngoài ra, kết quả của xét nghiệm HLA-B27 còn hỗ trợ trong việc lựa chọn thuốc điều trị một số bệnh tự miễn và xác định nguy cơ phát triển tác dụng phụ từ thuốc. Hiện nay, các kỹ thuật được dùng để phát hiện HLA-B27 có thể kể đến như: gây độc tế bào vi mô, Flow Cytometry, Real-time PCR, PCR-SSP, Microarray, giải trình tự v.v. nhưng phổ biến nhất vẫn là Flow Cytometry, PCR-SSP và Real-time PCR, với mỗi phương pháp đều có những ưu điểm khác nhau. ^{5, 6}

Flow Cytometry (Phân tích tế bào theo dòng chảy)

Flow Cytometry là một công cụ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như miễn dịch học, virus học, sinh học phân tử, sinh học ung thư v.v. Phương pháp này cho phép phân tích nhiều thông số của tế bào hoặc hạt đơn lẻ. Nguyên lý cơ bản của phương pháp đo có liên quan đến sự tán xạ ánh sáng và phát xạ huỳnh quang, xảy ra dưới dạng ánh sáng từ nguồn kích thích (thường là chùm tia laser) chiếu vào các hạt chuyển động trong dung dịch. Dữ liệu thu được có thể cung cấp thông tin có giá trị về các khía cạnh sinh hóa, lý sinh và phân tử. Khả năng tán xạ ánh sáng hoặc liên kết với thuốc nhuộm huỳnh quang phụ thuộc vào kích thước, cấu trúc bên trong và thành phần trên bề mặt tế bào. ^{7, 8}

 Xét nghiệm HLA-B27 sử dụng kháng thể đơn dòng kháng HLA-B27 có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang để kết hợp với kháng nguyên này (nếu có) trên bề mặt tế bào bạch cầu trong mẫu bệnh nhân (Hình 1). Sau đó, mẫu được phân tích nhờ hệ thống máy đo và phần mềm xử lý dữ liệu để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên HLA-B27.⁵

Hình 1: Quy trình thực hiện phương pháp Flow Cytometry⁹

Phương pháp Flow Cytometry có nhiều ưu điểm như thời gian thực hiện nhanh chóng, hiệu suất cao và chi phí tương đối kinh tế nhưng độ đặc hiệu lại thấp hơn so với các kỹ thuật PCR. Nguyên nhân của việc này đến từ sự hiện diện của các kháng nguyên HLA khác phản ứng chéo với HLA-B27 dẫn đến kết quả dương tính giả, đặc biệt là HLA-B7, HLA-B37. Các dòng kháng thể kháng HLA-B27 khác nhau có ái lực khác nhau với các kháng nguyên này. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng để tăng độ tin cậy, cần có tối thiểu hai kháng thể đơn dòng HLA-B27 sử dụng trong xét nghiệm. Đối với một số kết quả không thể kết luận, cần thực hiện các phương pháp khác như PCR hoặc giải trình tự để xác nhận. ¹⁰

PCR-SSP (Phản ứng khuếch đại chuỗi với mồi đặc hiệu theo trình tự)

Bên cạnh kỹ thuật Flow Cytometry, các phương pháp dựa trên PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng. PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primers) là một dạng của PCR, phương pháp nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Xuất hiện lần đầu tiên vào đầu những năm của thập niên 90, nguyên lý của kỹ thuật PCR-SSP dựa trên cơ sở thiết kế mồi khớp hoàn toàn với mạch khuôn sẽ cho hiệu quả nhân bản tốt hơn mồi không khớp (mismatched primers). Độ đặc hiệu được xác định bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu theo trình tự, trong đó sự không khớp nucleotide đầu 3' sẽ ức chế sự khởi đầu của một phản ứng không đặc hiệu, do enzyme Taq polymerase thiếu hoạt tính exonuclease 3' - 5'. Vì vậy, chỉ có allele mong muốn được khuếch đại có chọn lọc và sản phẩm có thể được phát hiện bằng điện di gel agarose. Kỹ thuật này được ứng dụng trong nhiều xét nghiệm như xác định đột biến điểm nucleotide đơn, xác định kiểu gene nhóm máu, phân nhóm HLA v.v. ^{11, 12}

Hình 2: Nguyên lý của kỹ thuật SSP-PCR ¹³

Trong xét nghiệm HLA-B27, mẫu DNA bộ gen đã tách chiết sẽ được khuếch đại bằng mồi đặc hiệu với allele HLA-B27. Sau khi phân tích bằng điện di gel agarose, nếu có sự xuất hiện của vạch điện di với kích thước mong muốn thì tương đương với sự có mặt của allele này trong mẫu. Ngoài ra, kỹ thuật PCR-SSP còn được sử dụng để xác định phân nhóm nhỏ của HLA-B27.¹⁴

Với ưu điểm độ nhạy, độ đặc hiệu cao và chi phí kinh tế, PCR-SSP thường được sử dụng trong các phòng xét nghiệm. Những kỹ thuật này vẫn tồn tại một số hạn chế như không thể phát hiện các mẫu HLA-B27 đồng hợp hay việc mở lại ống sản phẩm sau khi thực hiện PCR để điện di làm tăng nguy cơ ngoại  nhiễm.¹⁴

Real-time PCR (Phản ứng khuếch đại chuỗi thời gian thực)

Trong Real-time PCR, các sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng cách sử dụng chất nhuộm huỳnh quang. Các chất nhuộm này liên kết với các đầu dò oligonucleotide – gắn đặc hiệu với sản phẩm khuếch đại. Trong giai đoạn kéo dài, hoạt động exonuclease của enzyme sẽ phân hủy mẫu dò huỳnh quang và giải phóng chất nhuộm huỳnh quang từ vị trí gần với chất khử (quencher). Tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên sau mỗi chu kỳ nếu có sự khuếch đại xảy ra và được đo ở cuối mỗi chu kỳ qPCR. Việc theo dõi cường độ huỳnh quang theo thời gian thực cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm tích lũy. Các ứng dụng hiện tại của Real-time PCR bao gồm phân tích biểu hiện gen, phát hiện đột biến, phát hiện và định lượng mầm bệnh, phát hiện sinh vật biến đổi gen, phát hiện chất gây dị ứng, v.v. ^{15, 16}

Hình 3: Nguyên lý Real-time PCR ¹⁶

Để phát hiện gene mã hóa cho HLA-B27, mồi thường được thiết kế đặc hiệu với exon 2 hoặc exon 3 trên gene. Xét nghiệm bao gồm mồi bắt với gene giữ nhà như beta-globin, nhằm kiểm soát sự hiện diện của vật liệu tế bào trong mẫu. Kết quả xét nghiệm được tính toán dựa trên giá trị Ct mà không mở lại ống nghiệm sau phản ứng. Điều này khắc phục được hạn chế của các phương pháp PCR truyền thống. Ngoài ra, kỹ thuật Real-time PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, giúp nhanh chóng đưa ra kết quả xét nghiệm chính xác và xác nhận những trường hợp khó khăn.¹⁷

Giải Pháp Của Chúng Tôi:

Công ty TNHH Thiết bị Khoa học Kỹ thuật Việt Huy đang cung cấp bộ sản phẩm HLA-B27 REAL-TM, của hãng Sacace Biotechnologies - Ý. Sản phẩm hiện đang được sử dụng tại nhiều bệnh viện, phòng khám trên khắp cả nước.

Tài Liệu Tham Khảo:

1. Brewerton DA, Hart FD, Nicholls A, Caffrey M, James DC, Sturrock RD. Ankylosing spondylitis and HL-A 27. Lancet. 1973 Apr 28;1(7809):904-7. doi: 10.1016/s0140-6736(73)91360-3. PMID: 4123836.

2. Marc C. Hochberg, Alan J. Silman, Josef S. Smolen, Michael E. Weinblatt, Michael H. Weisman. Rheumatology (Sixth Edition). Mosby. 2015. Page iv. ISBN 9780323091381. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-09138-1.00251-5.

3. van Vollenhoven, Ronald. (2017). Evaluation and Differential Diagnosis of Polyarthritis. 10.1016/B978-0-323-31696-5.00042-5.

4. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh cơ xương khớp (Ban hành kèm theo Quyết định số 361/QĐ-BYT Ngày 25 tháng 01 năm 2014, Bộ trưởng Bộ Y tế).

5. Chheda P et al. HLA-B27 testing: A journey from flow cytometry to molecular subtyping. J Clin Lab Anal. 2018 Jun;32(5):e22382.

6. Parasannanavar DJ, Rajadhyaksha A, Ghosh K. Application of a Simple In-House PCR-SSP Technique for HLA-B* 27 Typing in Spondyloarthritis Patients. Arthritis. 2013;2013:504109. doi: 10.1155/2013/504109. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24490069; PMCID: PMC3880732.

7. McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview. Curr Protoc Immunol. 2018 Feb 21;120:5.1.1-5.1.11. doi: 10.1002/cpim.40. PMID: 29512141; PMCID: PMC5939936.

8. Aysun Adan, Günel Alizada, Yağmur Kiraz, Yusuf Baran & Ayten Nalbant (2016): Flow cytometry: basic principles and applications, Critical Reviews in Biotechnology, DOI: 10.3109/07388551.2015.1128876

9. F. Balny et at. 70e Congrès de l’AACC 2018 (American Association for Clinical Chemistry), IRBM News, Volume 40, Issue 1, 2019, Pages 1-33, ISSN 1959-7568,https://doi.org/10.1016/j.irbmnw.2018.12.001.

10. Sándor Baráth et al. Combined use of different antibody clones improves the efficiency of human leukocyte antigen B27 detection by flow cytometry. (2020). https://doi.org/10.1002/cyto.b.21989.

11. Welsh K et al. Molecular typing for the MHC with PCR-SSP. Rev Immunogenet. 1999;1(2):157-76. PMID: 11253945.

12. Musa et al. A simple PCR-SSP method for detection of HLA-B*15:02, *15:13, and *15:21. Turkish Journal of Biochemistry, vol. 48, no. 3, 2023, pp. 230-233. https://doi.org/10.1515/tjb-2022-0202.

13. Marino et al. (2008). The Human Major Histocompatibility Complex and DNA- Based Typing of Human Leukocyte Antigens for Transplantation.

14. Lara-Armi FF et al. Optimization of HLA-B*27 ALLELE Genotyping by PCR-SSP. Clinics (Sao Paulo). 2020 Oct 26;75:e1840. doi: 10.6061/clinics/2020/e1840. PMID: 33146354; PMCID: PMC7561065.

15. Artika IM et al. Real-Time Polymerase Chain Reaction: Current Techniques, Applications, and Role in COVID-19 Diagnosis. Genes (Basel). 2022 Dec 16;13(12):2387. doi: 10.3390/genes13122387. PMID: 36553654; PMCID: PMC9778061.

16. Wang-Shick Ryu, Chapter 4 - Diagnosis and Methods, Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses, Academic Press, 2017, Pages 47-62, ISBN 9780128008386, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-800838-6.00004-7.